中国科学院生物物理研究所王艳丽团队揭示了一种高切割活性的II-D型Cas9的结构与机制，为小分子量基因编辑工具的开发提供新思路。相关论文近日发表于《自然-通讯》
CRISPR-Cas系统是广泛存在于细菌和古菌的RNA引导适应性免疫系统，其中Cas9是II型系统的标志性蛋白，通过HNH和RuvC两个核酸酶结构域与crRNA及tracrRNA或单链sgRNA结合，实现靶向双链DNA切割。目前应用最广泛的SpCas9虽然切割效率高，但其分子量较大，限制了腺相关病毒（AAV）递送。因此，寻找更小且高活性的Cas9蛋白成为基因编辑领域的重要目标。
研究团队在宏基因组数据中鉴定出来源于硝化螺旋菌的II-D型Cas9——NsCas9d，仅由762个氨基酸组成，较常见的II-A/B/C型Cas9更为紧凑。通过体外切割实验发现，NsCas9d在与sgRNA形成至少20个碱基配对后，可实现与SpCas9相当的双链DNA切割活性。PAM识别实验显示，NsCas9d识别5′-NRG-3′ PAM序列，其中5′-NGG-3′可实现最高切割效率。
团队解析了NsCas9d-sgRNA-dsDNA三元复合物的2.86 ?冷冻电镜结构，首次完整呈现II-D型Cas9的HNH和RuvC结构域。结构显示，HNH催化中心正对切割位点，表明蛋白处于活性状态；PAM序列位于PI和WED结构域形成的正电结合通道内。切割产物为带3-nt 5′粘性末端的DNA，与典型Cas9产生平末端不同，这一特性有助于基因插入等操作中提高DNA修复效率。
在HEK293T细胞实验中，NsCas9d可成功靶向目的序列，实现基因编辑，但效率低于SpCas9。研究人员指出，通过结构优化和技术改进，有望提升NsCas9d的体内编辑效率，从而满足对小分子量、高活性Cas9的应用需求。
该研究得到了国家重点研发计划、北京市科学技术委员会、国家自然科学基金、北京市自然科学基金、中国科学院的项目资助。生物物理所生物成像中心为电镜数据收集提供了技术支持。
相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41467-025-62128-8
本文链接：研究揭示高切割活性的II-D型Cas9的结构与机制http://www.sushuapos.com/show-11-25850-0.html
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